En la rata y el ratón, la frecuencia de las mutaciones espontáneas es bien conocida debido a la existencia de miles de animalarios (bioterios) que crían líneas consanguíneas. En estos sistemas de cría, el acoplamiento entre progenitores muy emparentados facilita la observación de fenotipos mutantes debido a las mayores posibilidades de que las mutaciones se encuentren en el es- tado homocigota. (Más allá de los ratones de laboratorio, se sabe de la existencia de ratones mutantes usados por sacerdotes chinos, mil años antes de Cristo.) En términos generales, se considera a la mutación como espontánea porque el evento que la originó es desconocido.
La tasa de mutaciones espontáneas en el ratón es bien conocida debido a que ha sido utilizado por millones (durante muchos años) para estudiar los efectos de los agentes mutagénicos sobre el patrimonio hereditario. Se considera que la frecuencia de aparición de mutaciones espontáneas en el ratón es del orden de 5 x 10-6 por gameta y por generación, para las mutaciones recesivas, y de 2 x 10-7 por gameta y por generación, para las mutaciones dominantes. Esta tasa puede ser calculada analizando (a escala molecular) el genoma de dos cepas consan- guíneas que tengan ancestros comunes y que hayan divergido después de muchas generacio- nes de haber sido separadas (como sucede entre las sublíneas, ver Capítulo IV). El resultado de este cálculo es del mismo orden: 10-6 por generación. Dicho de otra forma, para un gen de tamaño mediano, podrá surgir una mutación espontánea cuando el gen se haya replicado 100.000 veces. En términos prácticos esto quiere decir que un ratón de entre 100.000 naci- dos portará una mutación recesiva en un locus determinado. De todas formas, esta tasa debe ser considerada como un valor promedio ya que existen loci que mutan mucho más frecuentemente que otros, llamados en inglés mutational hotspots. Por ejemplo, los sitios del genoma LAS MUTACIONES 207 donde la citosina se encuentra metilada (alrededor del 1%) suelen ser muy mutables y la mu- tación suele ser una transición G-C → A-T. Esta alta taza de mutaciones se observa con los loci Agouti, hairless y Kit (Dominant White Spotting o W), entre otros. En el caso de la mutación W, el locus Kit presenta una tasa de mutación 10 veces más elevada que el promedio.
En los capítulos precedentes hemos considerado la estructura y organización íntima del genoma como parámetros inmutables. Esta manera de presentar al genoma nos ha permitido explicar los mecanismos que reglan la transmisión de los caracteres de una generación a otra, pero no corresponde totalmente con la realidad. De hecho, como la gran mayoría de las estructuras biológicas, el genoma es objeto de cambios, más o menos radicales y más o menos frecuentes, conocidos como mutaciones. Una mutación es el cambio, en general irreversible, de una característica del genoma. Este cambio, que por otro lado puede no ser observado inmediatamente a nivel del fenotipo, se transmite como un nuevo rasgo hereditario y se presenta bajo las formas más variadas y sutiles. Las mutaciones son muy frecuentes en los mamíferos y presentan un interés considera- ble para los genetistas, además de su intrínseco valor evolutivo, por ser generadoras de diversidad genética. Todos los seres vivientes, sin excepción, sufren mutaciones en sus genomas y este proceso es fundamentalmente aleatorio. Las mutaciones pueden presentarse sobre células somáticas o germinales, en células embrionarias o adultas, en cada caso con consecuencias diferentes. Pueden afectar tanto secuencias que codifican para proteínas como secuencias regulatorias o repetitivas. Las mutaciones tienen ventajas e inconvenientes: una ventaja es que la aparición de mutaciones permite a los individuos adquirir polimorfis- mos (variabilidad genética) y por consecuencia evolucionar; un inconveniente es que la ma- yor parte de esas mutaciones tienen efectos deletéreos o patológicos, representados por las enfermedades hereditarias. Durante el transcurso del desarrollo embrionario temprano, las células del organismo se mul- tiplican a una velocidad muy rápida y por lo tanto pueden surgir muchas mutaciones. Dentro de esas mutaciones, muchas provocan la muerte de las células que las portan y son eliminadas del organismo. En otros casos, las mutaciones pueden impedir que las células se diferencien hacia un tejido en particular y son, por lo tanto, fuertemente contra-seleccionadas. Finalmen- te, algunas mutaciones no afectan ni las funciones ni la sobrevida de la célula, por lo que son transmitidas a las generaciones siguientes. En este último caso, el embrión estará constituido de una mezcla (de proporciones variables) de dos o más estirpes celulares, lo que se denomi- na un mosaico genético (en referencia a la heterogeneidad de su constitución genética). Las mutaciones no son siempre detectables en forma inmediata, por ejemplo si se presentan sobre genes que no forman parte (o dejaron de hacerlo) del repertorio de genes que se ex- presan en un determinado tejido, o si son mutaciones recesivas en estado de heterocigosis. Si la mutación aparece en un clon celular que contribuye con la formación de las gónadas, y por consecuencia de las gametas, aquella será transmitida a las generaciones siguientes y todas las células serán heterocigotas para la nueva mutación. En los adultos pueden presentarse mutaciones en aquellos tejidos con alto recambio (alta actividad mitótica), tales como la médula ósea, el intestino, los bronquios y la piel. Muchas veces las mutaciones somáticas pueden pro- vocar la transformación de las células en células tumorales, especialmente cuando afectan a oncogenes, genes supresores de tumores y genes de reparación del ADN. Podemos resumir diciendo que el evento mutacional es a la vez un fenómeno natural, universal, aleatorio e inevitable. Por el lado negativo, es la causa de las enfermedades hereditarias y el cáncer. Por el otro, las mutaciones favorecen la existencia de los alelos (formas alternativas de los genes), lo que permitió (indirectamente) el descubrimiento de las leyes que gobiernan la transmisión de los caracteres hereditarios y la aparición de una variada gama de modelos animales para enfermedades humanas (ver Capítulo IX). Con respecto a lo último, hay mu- chos casos donde el reconocimiento de un modelo murino homólogo a una enfermedad hu- mana ha permitido progresos en el manejo de esa enfermedad. Por ejemplo, el descubri- miento de un modelo murino para la alcaptonuria y la localización del gen en el ratón han permitido la localización del gen homólogo en el hombre. A medida que el conocimiento del genoma del hombre y los modelos animales se agrande (con la disponibilidad de sus secuencias completas), las perspectivas se presentarán aún más prometedoras. Por ejemplo, sería interesante investigar por qué una mutación ocurrida sobre el mismo gen de la distrofina tiene efectos tan diferentes en el ratón y en un niño afectado por la distrofia muscular de Duchenne. Como veremos más adelante, hay una necesidad imperiosa de generar nuevas mutaciones en el ratón con el objeto de poder evaluar la función de todos los genes y desarrollar nuevos modelos animales.
En las instalaciones de cría de roedores de laboratorio existen dos condiciones que favorecen el descubrimiento de animales mutantes. Por un lado, la cría de roedores con sistemas de apareamiento consanguíneo y, por el otro, la observación diaria y atenta de los animales por parte de los técnicos e investigadores. En ciertos casos, la modificación del fenotipo puede ser muy sutil y pasar desapercibida a la observación simple. En general, los mutantes son identifi- cados en dos etapas: primero, la observación de un fenotipo anormal que no corresponde al estándar de la línea consanguínea (animal fenodeviante), y segundo la confirmación de que la anomalía es hereditaria.
A la hora de estudiar un fenotipo mutante, es importante tener en cuenta dos aspectos básicos de las mutaciones: la penetrancia y la expresividad. Es muy común observar, según las líneas con- sanguíneas (o individuos), que un mismo genotipo presenta una expresión fenotípica de intensi- dad variable. En el ratón, la mutación brachyury (T), letal en estado homocigota pero que causa acortamiento de la longitud de la cola en los portadores heterocigotas, es una buena demostra- ción de este fenómeno. La longitud de la cola varía de un ratón heterocigota a otro, yendo desde una cola casi normal hasta prácticamente la ausencia de cola. La expresividad tiene en cuenta la intensidad de la expresión de un fenotipo a nivel individual y depende de los otros genes conte- nidos en el genoma (genes modificadores) y también de efectos ambientales. En el caso de la mutación brachyury la expresividad es extremadamente variable (Figura 7.2). Por otro lado, la penetrancia de un gen mide el porcentaje de portadores que expresa el fe- notipo mutante. En algunos casos, como las mutaciones nude y hairless, el 100% de los ani- males que son homocigotas para la mutación expresan el fenotipo sin pelo, en este caso se habla de penetrancia completa o total. Otras mutaciones, en cambio, pueden presentar ani- males que a pesar de portar la mutación no expresan el fenotipo, como sucede con algunos ratones SCID (scid/scid) que escapan al fenotipo clásico, representado por la ausencia de lin- focitos B y T maduros (fenómeno conocido en inglés como leaky phenotype). Determinación de la base genética de un fenotipo mutante Ante el hallazgo de un fenotipo anormal surgen tres preguntas fundamentales: (i) ¿Está este rasgo determinado genéticamente? (ii) ¿Es un carácter genético simple (monogénico) o com- plejo (poligénico)? (iii) ¿Es un nuevo alelo de una mutación ya descripta? Existen varias formas de confirmar que el nuevo carácter es hereditario: 208 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO LAS MUTACIONES 209.
La expresividad de las mutaciones. Dos ejemplos de variabilidad en la expresión son las viejas mutaciones brach- yury y piebald. La mutación semidominante brachyury (T) es letal en estado homocigota pero causa acortamiento de la longitud de la cola en los heterocigotas. La longitud de la cola varía de un ratón a otro, desde una cola casi normal hasta la casi ausencia de cola. La foto de arriba muestra la variabilidad en la intensidad de la expresión del fenotipo a nivel individual en ratones heterocigo- tas T/+. El otro ejemplo es la mutación piebald (ahora Ednrbs). La foto de abajo muestra la variabilidad en el tamaño de las áreas blancas (ausencia de melanocitos) en ratones homocigotas Ednrbs/Ednrbs; dicho tamaño está influenciado por diferentes genes mo- dificadores. Fotos Jean-Louis Guénet, Unité de Génétique des Mammifères, Institut Pasteur, París, Francia. Primero, acoplando el supuesto mutante (si es fértil), con animales normales –no emparenta- dos– para analizar su descendencia. Los resultados posibles son : (i) Si en las crías de esta cruza encontramos animales mutantes (portando la misma anoma- lía) en una proporción cercana al 50% y el resto de aspecto normal, esto quiere decir que la mutación es dominante (el alelo mutante se expresa igual, más allá de la naturale- za del otro alelo). El símbolo del alelo mutante se deberá escribir en cursiva y con la letra inicial en mayúscula, por ejemplo Mut (por mutante), y el alelo normal o salvaje (del in- glés, wild type) se simboliza con el signo “+” (Figura 7.3). En la práctica, la gran mayoría de los animales Mut/Mut mueren antes de nacer y se conocen muy pocas mutaciones es- trictamente dominantes, en el sentido de que no se pueda distinguir los animales de ge- notipo Mut/Mut de aquellos Mut/+. Además, muchas mutaciones dominantes tienen fe- notipos muy sutiles y con grandes variaciones en la expresividad. Los ejemplos más desta- cados son las mutaciones Caracul (Ca), cromosoma 15, Rex (Re), cromosoma 11, y Trembler (Tr) también en el cromosoma 11 (ahora Pmp22Tr, del inglés peripheral myelin protein, 22 kDa). 210 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO Figura 7.3 Determinación de la base genética de un fenotipo mutante. Si la mutación es dominante (A), al cruzar un ra- tón afectado con uno normal (no relacionado), el 50% de las crías será mutante y el otro 50% normal. Si todos los individuos F1 re- sultantes de la cruza propuesta son de fenotipo normal quiere decir que la mutación (de existir) es recesiva (B). Para demostrarlo de- bemos cruzar los animales F1 entre sí para obtener la generación F2: si la mutación es recesiva, el 25% será mutante (mut/mut) y el 75% normal (50% mut/+ y 25% +/+). (ii) Si todos los individuos F1 resultantes de la cruza propuesta son de fenotipo normal quiere decir que la mutación (de existir) será recesiva (los efectos fenotípicos del alelo mutante son suprimidos por la presencia del alelo normal). En este caso el símbolo del alelo mutante deberá expresarse en cursiva y minúscula, por ejemplo mut. Para demos- trar esto debemos cruzar los animales F1 entre sí (intercruza F1 x F1) para obtener la generación F2. Podemos confirmar que la mutación es recesiva si entre los animales F2 obtenemos un 25% de mutantes (mut/mut) y un 75% de normales (+/+ y +/mut) (Figura 7.3). (iii) Un último resultado posible puede darse cuando, siendo el animal afectado un macho, observamos que en la F1 todos los animales son normales. Los machos F1 reciben el cromosoma Y del padre (ratón mutante) y un cromosoma X normal de la madre (ratón normal); las hembras F1 reciben el cromosoma X mutado del padre y uno normal de la madre, por lo tanto, el 100% de las hembras será portadora. En la F2 (luego de cruzar los F1 entre sí), sólo el 50% de los machos presenta de nuevo la mutación. En este caso, la mutación es recesiva y ligada al sexo (portada por el cromosoma X). En el caso de una mutación dominante ligada al sexo, todas las hembras F1 serán mutadas (por recibir el cromosoma X mutado del padre) y los machos normales. En la generación F2, el 50% de los machos y el 50% de las hembras presentarán de nuevo la mutación. Es necesario resaltar que estos cálculos son teóricos y en realidad, dentro de las pocas muta- ciones ligadas al sexo que encontramos en el ratón, las cruzas se suceden de otra forma. Esto es debido a que la transmisión de las mutaciones ligadas al cromosoma X es bastante com- pleja y muchas veces depende del sentido de los cruzamientos. Tomemos como ejemplo la mutación espontánea semidominante Tabby (Ta), gen Eda (ectodysplasin-A) (ahora EdaTa), de la cual existen alrededor de 20 alelos mutantes surgidos en forma independiente. Los machos Tabby (hemicigotas Ta/Y) y las hembras heterocigotas (Ta/+) se reproducen normalmente, pero no así las hembras homocigotas (Ta/Ta) que suelen ser infértiles. Los machos hemicigo- tas y las hembras homocigotas comparten el mismo fenotipo, caracterizado por la ausencia de pelos guard y zigzag, zonas de alopecia detrás de las orejas y defectos en la cola y los dientes.
Las hembras heterocigotas se reconocen fácilmente (en particular sobre fondo agutí) por su pelaje característico con bandas transversales de color oscuro. Si cruzamos una hembra ra- yada (Ta/+) con un macho normal (+/Y), obtendremos hembras rayadas (Ta/+) y normales (+/+), así como machos mutantes hemicigotas (Ta/Y) y normales (+/Y). Segundo, se pueden acoplar (si están disponibles) los padres del supuesto mutante con ani- males normales (no emparentados) para luego cruzar las crías F1 entre sí. Esto es esencial cuando los animales portadores de la anomalía (supuesta mutación) son infértiles o mueren al destete antes de la madurez sexual. Si encontramos animales mutantes en la descendencia, quiere decir que la mutación es dominante pero que el progenitor que está transmitiendo el alelo mutante no porta la mutación en forma somática (por eso su fenotipo es normal), sino que posee una gónada mosaico, con células mutantes y células normales. En este caso, la mu- tación no podrá ser conservada por los métodos clásicos de cría. LAS MUTACIONES 211 Finalmente, se puede cruzar (entre sí) a los padres del supuesto mutante para ver si vuelven a tener otra cría con el mismo defecto, e involucrar en los cruzamientos a los hermanos del mutante. En el caso que ninguno de los cruzamientos anteriores nos dé información útil, sólo queda cruzar de diversas formas el núcleo original donde apareció el mutante; es decir, her- mano x hermana, padre x hija, madre x hijo, etcétera. Al obtener algún individuo mutante en- tres las crías estaríamos confirmando que se trata de una mutación recesiva. Con respecto a la determinación de la base genética de las mutaciones, es importante tener pre- sente la existencia de animales denominados fenocopia. Se habla de fenocopia cuando un individuo simula una mutación pero no posee la misma información genética (genotipo). Por ejemplo, si a un ratón normal se le administra aloxano, éste destruye las células pancreáticas y produce diabetes, por lo que siendo genéticamente normal es una fenocopia de los ratones genéticamente diabéticos. 7.3.3 El vacío fenotípico (Phenotype Gap) Con la disponibilidad de las secuencias completas de los genomas de organismos eucariotas (ver Capítulo VI), ha nacido una nueva era denominada post-genómica cuyo énfasis está puesto en el estudio sistemático de la función de los genes. Una de las rutas hacia ese estudio sistemático es a través del análisis y la generación de nuevos mutantes. Aunque a primera vis- ta pudiera parecer que existen suficientes ratones mutantes, sólo existen mutaciones para una fracción mínima del total de genes de los mamíferos (alrededor del 10%), hecho que se co- noce como “vacío fenotípico” (del inglés phenotype gap). Por ejemplo, el modelo murino de la alcaptonuria, enfermedad humana autosómica recesiva descubierta a principios del siglo XX por Archibald Garrod, fue descubierto recién 90 años más tarde. Este descubrimiento fue re- alizado, al azar, en el Institut Pasteur, debido a que los ratones homocigotas para la mutación aku (gen Hgd, ahora Hgdaku) ennegrecían la viruta con su orina (ver Capítulo IX). La alcapto- nuria es un desorden del metabolismo de la tirosina como resultado de un defecto en la enzi- ma oxidasa del ácido homogentísico. Este ácido es excretado en la orina y se vuelve de color negro con la exposición al aire. Tal es la importancia de descubrir nuevas mutaciones que, en el ratón, existen varios proyectos internacionales abocados a la búsqueda de fenotipos mutantes, espontáneos e inducidos por mu- tágenos químicos o manipulación genética. Como veremos más adelante, a la cabeza de estos proyectos se encuentran varios grupos trabajando exclusivamente en la generación de mutantes por mutagénesis química. Por otro lado, en el Jackson Laboratory (Estados Unidos) existen pro- yectos como el Mouse Mutant Resource (MMR) y el Induced Mutant Resource (IMR) que cuentan con una producción anual de tres millones de ratones (ver http://www.jax.org/resources/docu- ments/imr/). Más allá del sistema utilizado, debido a la baja saturación de mutaciones en el geno- ma del ratón, la gran mayoría de las mutaciones inducidas se produce sobre nuevos loci. Recor- dar que la característica más importante de las mutaciones es que se transmiten genéticamente y, por lo tanto, pueden ser propagadas y mantenidas a lo largo del tiempo. Por más valiosa que sea una nueva mutación será inútil si no está disponible para los investigadores. 212 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO Los programas de descubrimiento y caracterización de nuevas mutaciones se ocupan de iden- tificar nuevos mutantes que puedan tener alguna importancia en el área biomédica. Cada ani- mal que presenta un nuevo fenotipo mutante es cruzado con una línea consanguínea no rela- cionada para determinar si esa característica es transmitida a la descendencia, y de qué mane- ra lo hace. A su vez, cada nueva mutación es evaluada para detectar un posible alelismo con mutaciones ya descriptas y de fenotipo similar. Finalmente, se realiza la caracterización básica de los animales mutantes que incluye la búsqueda de defectos anatómicos (en la observación grosera y en la necropsia), el análisis histopatológico de todos los tejidos y los estudios bio- químicos de sangre y orina. Luego son derivados a los distintos especialistas en inmunología, endocrinología, desarrollo embrionario, reproducción y neurología, entre otros. 7.4. Los agentes mutágenos Junto con la toma de conciencia del peligro que representa la polución ambiental sobre la salud pública, en especial sus efectos cancerígenos, se ha incorporado la noción de agente mutágeno. En realidad, hace muchos años que los investigadores tratan de identificar agentes, o sustancias, capaces de aumentar la frecuencia de las mutaciones espontáneas, casi desde que se comenzó a trabajar en genética experimental. El ratón ha sido muy utilizado en los estudios concernientes a evaluar el riesgo de la utilización de la energía nuclear. Por un lado, William Russell y su esposa, L. B. Russell, en Oak Ridge Laboratories de Estados Unidos; y por el otro Mary F. Lyon, Bruce M. Cattanach y A. G. Searle en Harwell, Inglaterra, han consagrado la mayor parte de sus carreras a este tipo de investigaciones. Además de las radiaciones y los agentes químicos, debemos tener en cuenta aquellos virus capaces de generar mutagénesis por inserción. Actualmente, muchos fenómenos relacionados a la mutagénesis han sido aclarados y sabe- mos, en particular, que la mayor parte de las radiaciones y muchos agentes químicos son ca- paces de inducir mutaciones sobre el genoma de los mamíferos con una eficacia variable. Hoy en día, los genetistas han ideado herramientas muy útiles para evaluar la actividad mutagénica de un compuesto por medio del uso de ratones transgénicos. Estos valiosos modelos son los ratones BigBlue y MutaMouse, ambos transgénicos para genes reporteros de origen bacteria- no. El primer modelo porta copias del gen lacI y el segundo del gen lacZ, en ambos casos dentro de un vector viral (bacteriófago lambda). El método de detección de mutaciones es muy sencillo y se realiza por medio de métodos colorimétricos en placas de cultivo (para más detalles ver http://eden.ceh.uvic.ca/intro.htm). Estos modelos murinos pueden ser empleados para evaluar la toxicidad genética o la taza de mutaciones in vivo.
Mutaciones tradicionales versus mutaciones dirigidas
Las mutaciones identificadas hasta el momento en los roedores de laboratorio pueden ser de dos tipos: (i) Aquellas que aparecieron espontáneamente o después de un tratamiento mutagénico. Son alrededor de 1500 en el ratón, 200 en la rata, y no más de unas decenas en el háms- ter, el jerbo y el cobayo en conjunto. En la mayoría de los casos, estas mutaciones se tra- ducen en un fenotipo patológico. A este tipo de mutaciones se las conoce como muta- ciones tradicionales. (ii) Aquellas que resultan de la manipulación in vitro del genoma de células embrionarias to- tipotentes (células ES, del inglés embryonic stem cells) por recombinación homóloga . A estas mutaciones se las denomina mutaciones dirigidas (del inglés targeted mutations), y son posibles, al momento de este escrito, sólo en el ratón. Actualmente son más numerosas que las mutaciones tradicionales y su número crece velozmente. In- formación detallada sobre muchas líneas de ratones mutantes se puede encontrar en In- 202 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO ternet (http://tbase.jax.org/).
A este acercamiento en el cual se producen alelos mutantes en genes conocidos se lo conoce en inglés como “gene-driven mutagenesis”, en oposición a la mutagénesis experimental en la cual genes desconocidos son identificados en base a cambios fenotípicos (“phenotype-driven”). Las mutaciones tradicionales y las dirigidas se oponen en varios aspectos. Si bien un número constante de mutaciones tradicionales ha sido clonado por un enfoque posicional (positional cloning) en los últimos años, una gran parte es desconocida en términos moleculares. En la mayoría de los casos, las mutaciones tradicionales sirven para identificar nuevos genes, aunque son también fuente de nuevos alelos en loci ya conocidos. En cambio, las mutaciones dirigidas son bien conocidas en términos moleculares ya que se producen a partir de secuencias clona- das, pero, en general, no son fuente de identificación de nuevos genes. Las mutaciones tradicionales tienen en general un fenotipo muy evidente, contrariamente a las mutaciones inducidas in vitro, que tienen a menudo un fenotipo “engañoso”; el mismo suele ser muy severo (lo que provoca la muerte del animal a un estadio muy precoz del desarrollo) o muy discreto (compatible con un desarrollo normal). En estas condiciones, las mutacio- nes tradicionales son a priori un mejor modelo para las patologías humanas que las mutacio- nes inducidas; aunque la descripción de nuevas técnicas de mutagénesis condicionadas al tejido y momento adecuados están cambiando el panorama .
Las mutaciones dirigidas, producidas por recombinación homóloga, conllevan la interrupción de una secuencia codificante y comúnmente generan genes que no son traducidos a proteínas (alelos nulos). Por el contrario, los mecanismos que generan las mutaciones tradicionales son muy numerosos, de origen diverso, y aportan mucha información sobre la estructura y los mecanismos de regulación de los genes en los mamíferos. El albinismo es un ejemplo interesante de la variedad de las mutaciones tradicionales ya que existen alrededor de 100 alelos espontáneos y generados por radiación que presentan cam- bios sutiles en la molécula de la enzima tirosinasa. El albinismo en los roedores de laborato- rio es equivalente al albinismo oculocutáneo tirosinasa negativo en los seres humanos, la for- ma más común de esta enfermedad autosómica recesiva. La tirosinasa es una enzima esen- cial para la producción de melanina a partir de tirosina, en particular los pasos de conversión hacia dihidroxi-fenil-alanina (DOPA) y DOPA-quinona. En los ratones, el alelo himalayan (Tyrc-h) está asociado a una mutación sin sentido en el codón 422 que resulta en la produc- ción de una enzima termo sensible con producción de melanina sólo en las regiones mas frí- as del cuerpo, como las extremidades de las orejas y las patas (equivalente a la mutación presente en los gatos Siameses). Este es sólo un ejemplo de la sutileza de los cambios debi- dos a mutaciones que podemos encontrar en la función de una proteína. Otros alelos de la tirosinasa con un fenotipo particular son extreme dilution (Tyrc-e), chinchilla mottled (Tyrc-m), platinum (Tyrc-p) y ruby eyed dilute (Tyrc-r), entre otros. Como veremos más adelante, muchas mutaciones generadas por agentes químicos son del tipo puntual (transiciones o transversiones de bases) y a veces no implican más que una pérdida par- cial de la actividad de la proteína. De esta manera, el estudio molecular de mutaciones tradicionales LAS MUTACIONES 203 204 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO les aporta casi siempre información original y transferible a la especie humana. Para una breve descripción de los mutantes más usados como modelo de enfermedades humanas.
Teniendo en cuenta la naturaleza de la alteración a nivel del genoma, los genetistas clasificaron históricamente a las mutaciones en puntuales y cromosómicas. Las mutaciones cromosómicas eran aquellas detectables con la ayuda del microscopio óptico. Las mutaciones puntuales (o génicas) correspondían a una alteración que no era detectable por los medios habituales de observa- ción de cromosomas. Esta subdivisión de las mutaciones se remonta a la época en la cual el mi- croscopio óptico era el único medio disponible para visualizar algún cambio a nivel del material hereditario. Por lo tanto, las mutaciones indetectables por este simple análisis cromosómico (pero reconocidas como tal por su efecto), fueron designadas con el término general de muta- ciones puntuales, en oposición a las visibles como rearreglos cromosómicos. La noción de muta- ción puntual fue evolucionando con el tiempo y actualmente sabemos que comprende un en- samble de varios eventos diferentes a nivel del ADN. En algunos casos se trata de cambios muy simples, como el reemplazo de un nucleótido por otro (sustituciones), mientras que otras veces hay un corrimiento completo del marco de lectura sobre uno o varios exones, como consecuen- cia de deleciones o de intercalaciones de segmentos de ADN.
Sustituciones La sustitución de un nucleótido por otro puede ser diferenciada en dos clases de eventos. La transición es el reemplazo de una base pirimídica por otra base pirimídica o de una púrica por otra púrica. En cambio, la transversión es el reemplazo de una base pirimídica por una base púrica o viceversa . Consideremos un triplete de ARNm, tal como UGC, que codifica normalmente para el ami- noácido cisteína. Este triplete puede ser modificado de diferentes formas por sustitución de nucleótidos, pero analizaremos sólo las concernientes a la tercera base, la citosina. Si esta ci- tosina es reemplazada por uracilo –la otra base pirimidínica del ARN el triplete deviene en UGU. Esta transición no tiene ningún efecto sobre el producto del gen porque UGU, tanto como UGC, codifican para el aminoácido cisteína. Este tipo de mutación es llamada silen- ciosa. En otro caso de transversión, si la citosina (base pirimídica) es reemplazada por una adenina (base púrica) se forma el codón UGA que es una de las señales de detención de la traduc- ción, por lo tanto la cadena polipeptídica va a interrumpirse en forma prematura, generando una proteína trunca sin función biológica. Estas sustituciones se llaman mutaciones sin sentido LAS MUTACIONES 205 Figura 7.1 Las sustituciones. Las mutaciones por sustitución de nucleótidos pueden ser transiciones, cuando una base es reem- plazada por otra base del mismo tipo, y transversiones, cuando una pirimidina es reemplazada por purina, o viceversa. En conjunto, hay cuatro transiciones y ocho transversiones posibles. (del inglés nonsense mutations). Por ejemplo, si el gen afectado es la tirosinasa, la melanina no será elaborada y la coloración del animal portador de la mutación (en estado homocigota) es- tará suprimido, como es el caso ya visto del albinismo. La última forma de modificar la “letra” final del codón UGC consiste en reemplazar la citosina por una guanina (transversión), formando el nuevo triplete UGG. En este caso, el cambio provoca la incorporación a la cadena polipeptídica de un aminoácido diferente (el triptofano en lugar de la cisteína) y las consecuencias son variadas, en función del sitio de la sustitución y los cambios en la estructura física de la proteína (por ejemplo la función biológica se verá mu- cho más afectada si la sustitución se produce cerca del sitio activo). Este tipo de sustitución se conoce como una mutación de sentido erróneo (del inglés missense mutations). En el caso de que no se modifique la función y sólo se alteren las características físico-químicas de la proteína, se genera una aloproteína (por ejemplo, las aloenzima son variantes electroforéticas de una isoenzima). Las mutaciones que corren el marco de lectura de los codones en la mo- lécula de ARNm son llamadas mutaciones por corrimiento de lectura (del inglés frameshift mutations) y se deben normalmente a sustituciones o a pequeñas deleciones. Las mutaciones que provocan sustitución de aminoácidos en la cadena polipeptídica son muy frecuentes y representan lo que se ha convenido en llamar polimorfismo bioquímico. Se trata de mutaciones presentes en las poblaciones naturales y que juegan, quizás, un papel impor- tante en la evolución. En el hombre, se conocen muchas mutaciones de este tipo y una gran par- te de ellas está asociada a patologías hereditarias. Es el caso, por ejemplo, de la anemia falciforme, la cual resulta de una transversión A>T en el sexto codón del primer exón del gen de la β globi- na, lo que se traduce en la incorporación de una valina (GTG) en lugar de un ácido glutámico (GAG). En el ratón, se conocen también numerosos ejemplos, ya sea entre los genes de las glo- binas o cientos de otros genes en los cuales se han producido mutaciones inducidas por produc- tos químicos mutágenos. Las sustituciones de bases que acabamos de ver se traducen en muta- ciones que cambian la significación del mensaje codificado en los exones; pero existen también otras mutaciones puntuales que interfieren en la señal de comienzo de la transcripción (cajas TATA y CAAT) o los sitios de corte y empalme (splicing) del mensajero.
Deleciones e inserciones Existen mutaciones que conllevan la deleción de un segmento de ADN de tamaño variable, desde algunas bases hasta cientos de kilobases. Es el caso de la mutación mdx (Dmdmdx) en el ratón (réplica de la distrofia muscular de Duchenne en el hombre), en la cual una deleción provoca la transcripción de un mensajero anormal y, en definitiva, la falta de distrofina, una proteína importante para el funcionamiento del músculo. Como veremos más adelante, las mutaciones generadas por radiación X suelen comprender grandes deleciones, como es el caso de la mutación murina nackt (Ctslnkt), donde el gen de la catepsina L (Ctsl) se encuentra anulado por una deleción que abarca dos exones. Como hemos visto en el Capítulo I, el genoma de los mamíferos contiene miles de copias de distintos tipos de secuencias de ADN llamadas retroposones (en inglés, retroposons o trans- 206 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO posable elements). Estas secuencias son también una fuente de nuevas mutaciones por inser- ción. La inserción no es la única forma en la que los retroposones pueden causar mutaciones. Al encontrarse dispersos en miles de copias homólogas a lo largo del genoma, estas secuen- cias pueden favorecer fenómenos de recombinación con deleción de segmentos de ADN. Los retrovirus, en particular el de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), son capaces de provocar mutaciones intercalándose en un gen bajo la forma de un provirus (en inglés, inser- tional mutagenesis). Este descubrimiento fue realizado por primera vez en el ratón por los in- vestigadores Nancy Jenkins y Neal Copeland (Estados Unidos), cuando determinaron que la mutación dilute (Myo5ad) estaba asociada a la presencia en el ADN de un retrovirus. Este también es el caso de la mutación hairless (hr) asociada a una retrotransposición viral.
La uniformidad del fondo genético en el cual mantenemos la mutación (o transgén) es de suma importancia. El fenotipo observado en el animal mutante no es siempre consecuencia directa de la alteración genética del gen, sino que existen facto- res ambientales e interacciones con otros genes (genes modificadores). Se ha descripto en numerosas ocasiones la presencia de cambios en el fenotipo de una mutación por el sólo he- cho de introducir el alelo mutante en otra línea consanguínea. Un ejemplo de lo último en el ratón es la mutación espontánea (oncogénica) ApcMin, la cual provoca una gran incidencia de tumores intestinales en la línea C57BL/6J, pero una incidencia mucho menor en la línea AKR. Este fenómeno fue explicado por la presencia de un gen modificador (aunque no el único) llamado Mom1 (Modifier of Min); la línea C57BL/6 porta un alelo nulo del gen, mientras que AKR tiene una copia salvaje del mismo, la cual protege de la aparición de tumores intestinales. (Es interesante notar que sin el conocimiento previo de la mutación ApcMin, el gen Mom1 difí- cilmente hubiese sido descubierto.) Como hemos señalado en el Capítulo IV, la creación de líneas congénicas, por medio de re- trocruzas repetidas contra una línea de fondo, es una alternativa ideal para mantener muta- ciones espontáneas (muchas veces descubiertas en un fondo genético no definido o mixto) y dirigidas, tanto como transgenes. Esto es particularmente importante en el caso de los anima- les transgénicos y KO, debido al hecho de que, por cuestiones técnicas, suelen ser producidos en fondos mixtos del tipo FVB;B6 o 129;B6, respectivamente (ver Capítulo VIII). Una ventaja adicional de este método es la posibilidad de analizar el fenotipo mutante en más de un fon- do genético definido; por lo tanto, se aconseja realizar más de una línea congénica por cada mutación. Para una breve reseña práctica de cómo mantener las mutaciones en los animalarios.
